snRNA-seq
数据概览桑基图
大概是实验设计如此，并没有找到哪个数据包含了实验组条件对应的损伤模型、损伤后取样时间，在文中也没有显式提及，找了几个隐晦提及的地方：
- b, Susceptible and resilient subtypes of spinal cord neurons. Volcano plot shows log2 odds ratios comparing neuron proportions between the uninjured spinal cord and each injured condition at 7 days post injury (x axis) versus statistical significance (t-test, y axis).
- b,c, Chronophotography (b) and walking performance (n = 5 each) (c) of young and old mice after spontaneous recovery from moderate crush SCI.
实验设计大概就是：
- 一组未受伤组
- 损伤后时间组（1天、4天、7天、14天、1个月、2个月）和治疗组之类的全部为中等挤压损伤
- 不同类型损伤组（轻度挤压、中度挤压、严重挤压、完全挤压、挫伤、半切）和部分药物治疗组（甲强龙和米诺环素）全部为损伤后7天取样
- 其余为基因治疗组（ChABC和荧光蛋白的对照），为损伤后2月取样
然后手动写桑基图的数据，最后每个实验组的数量都一样，得出：
数据读取
主要是因为这个features.tsv的格式，Read10X()要用gene.column = 1参数。
质控
筛feature和count和线粒体基因与其他比起来有显著差异的低质量组，snRNA-seq筛掉了2个，应该先验证方差齐性之类的然后用ANOVA、kruskal检验之类的，但是跑了半天才发现读出来的数据已经是52只小鼠的435099个细胞了，所以跳过。
修正： 经过对比UMAP图，发现作者还是少了几团细胞，然而，数据中的最低nCount是201，所以作者给出的“原始数据”其实经过了质控，但是没有完全质控，现在发现少突胶质细胞的尾巴似乎可以通过DecontX来去除，另外一些可能要进行双细胞的筛选。
双细胞筛选
作者用了DoubletFinder和scDblFinder然后取并集。
对于DoubletFinder来说，似乎应该分组分得细一点，到library这个级别。
而对于scDblFinder来说，假如要用BiocParallel并行计算，似乎因为Matrix 1.6.5删除了一些函数，会报错，Matrix 1.6.1可以解决（但是最新的SeuratObject又需要Matrix 1.6.4以上，和nodeJS一样的麻）。
再次修正： 跑了一堆双细胞和DecontX之后，结果越来越奇怪，认为此数据已经经过完全质控，证据如下：
- 上述的原数据就已经是52只小鼠的435099个细胞，并且nCount最低是201
- 作者的元数据中有着5层的细胞类型数据
所以还是跳过。
整体可视化
PCA
作者说了用50维，但还是画个elbow图看一下效果，得到：
发现50维也还行（甚至有点过了）。
整合
reduction参数用'pca'会报错，但是默认参数就是PCA，不管。
Leiden法聚类
leiden法需要用到Python，R不搞代理和镜像，reticulate包可能安不上各种包，开root用pip安装leidenalg、numpy、igraph。
根据seurat#2294，对于这个435099个细胞的数据，leidenalg有一个很坑的地方就是会把数据转换成稠密矩阵，VIRT直接1400g，需要用method = "igraph"强制使用稀疏矩阵。
UMAP
用于可视化的降维，一个是原文用的UMAP，另一个是UMAP时间复杂度是\(O(n^{1.2几})\)，而t-SNE是\(O(n^2)\)，近50万个细胞怕是顶不住。（这里min.dist参数设0.2比较好看点）
类型注释
说是manually annotated on the basis of marker gene expression, guided by previous studies，用几个marker试一下少突胶质细胞：
那标cluster 1、3、13为少突胶质细胞，和原文基本一致（但是原文13找不到）。
然后找了一些marker做了一张恐怖的图x
有一个报错是
1 | Error in `levels<-`(`*tmp*`, value = if (nl == nL) as.character(labels) else paste0(labels, : |
这是因为DotPlot()传入了两个重复的feature参数（在这里是marker）。
cluster
13感觉比较奇怪，似乎是少突胶质细胞和神经细胞的合体，试着用findDoubletClusters()，是阴性，而且听别人讲这个方法只能用于同批次的数据。
再次回顾元数据，将里面的cluster等字段用UMAP可视化，发现一些原文的cluster在经过上述分析后被分开了。
而作者声称在进行聚类之后删掉了一些cluster，结合上面质控时质控后二次分析结果越来越奇怪来看，我认为：
重复质控将去除某些cluster内过渡的液滴，使得原来的整个cluster被分割开
这个cluster 13或许也是有问题的，有可能是双细胞？但是先按着作者的思路不管，接下来仅走一个亚群注释的流程，在之后的分析使用作者的元数据。
可视化
先是原始数据的可视化，还没研究作者的图例：
然后是聚类结果的可视化：
